【文献阅读—钟欣】在肝脏炎性损伤中，Jagged1介导的髓系Notch1信号激活HSF1和Snail,抑制NLRP3炎症小体活化（肝脏在身体里的作用）

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一．背景介绍

1.Notch信号通路

1917年，Morgan及其同事在突变的果蝇中发现Notch基因，因该基因的部分功能缺失会在果蝇翅膀的边缘造成缺口（Notch）而得名。

Notch信号通路：Notch信号通路调节多种细胞过程，包括细胞增殖、分化、死亡、干细胞维持和调节免疫细胞功能。

Notch 信号通路由四部分组成：Notch 受体 (Notch1/2/3/4)，Notch 配体 (Delta-like ligands, DLL1/3/4；Jagged ligands, JAG1/2)，CSL-DNA 结合蛋白，下游靶基因 (Hes 家族，MYC 等)。以上 4 个因素，任何一个因素改变都会对 Notch 信号传递产生影响。

大多数经典的信号通路 (如 NF-KB,MAPA信号通路) 遵循“信号-受体-信号转导 (产生二次信使)-细胞核-转录”的信号级联放大模式，而 Notch 通路则不按照这个套路出牌：Notch 受体与邻近细胞的配体相互作用介导短时通讯，从细胞表面到细胞核基因组的信号是直接的，线性的，没有信号级联放大的过程。

Notch 的受体和配体都是膜蛋白，Notch 受体与配体结合后，经过酶切，把有转录调节活性的 Notch 蛋白片段 (NICD ) 释放出来，再与转录因子 CSL 结合，调节下游基因表达。

Notch 通路的著名“三剪”

第一剪

Notch 以无活性的单肽前体形式在内质网中合成，此时的未成熟蛋白包括 Notch 膜外受体部分，跨膜区域以及胞内结构域 NICD 三个部分。

Notch 初始蛋白被合成之后，转运至细胞高尔基体内，被高尔基体网络中的 Furin 转化酶蛋白水解切割，经过第一次酶切 (S1 cleavage) 后形成异二聚体形式的成熟 Notch 受体并转运至细胞表面。

第二剪

细胞膜上成熟 Notch 异二聚体的胞外结构域与其他细胞的配体结合，受体配体结合后发生构象变化，在 ADAM 金属蛋白酶 (ADAM10 或 ADAM17/TACE) 切割的作用下发生第二次酶切 (S2 cleavage)，此刻受体膜外部分完全被切掉。

第三剪

第二次酶切后剩余的其他部分，被 γ-分泌酶进行关键性的最后一切 (S3 cleavage)，形成可溶性 NICD 入核。

NICD 进入细胞核后，与 CSL 转录蛋白结合，激活下游相关基因的表达。

2.Snail

Snail家族的转录因子包括Snail1（Snail）、Snail2（Slug）和Snail3（Smuc），在细胞发育和分化过程中发挥重要作用，该基因参与诱导上皮间质转化（EMT）、胚胎中胚层的形成和维持、生长停滞、存活和细胞迁移。

有文献报道激活Snail可诱导抗炎细胞因子并调节免疫反应。在组织炎症和损伤期间，Snail通过调节TGF-β信号传导促进伤口愈合[1]。

此外，Snail通过ROS介导的途径调节细胞生长，破坏Snail信号传导被证明会增加ROS的产生，导致细胞在氧化应激下的存活率下降[2]。这表明Snail可能在调节ROS介导的炎症方面发挥重要作用。

3.HSF1

HSF1：HSF1（热休克因子1）是细胞对热和其他各种压力源反应的主要转录调节器。HSF1水平的提高通过协调各种基本的细胞过程,有助于细胞应对各种压力。

先前的文献已证明了HSF1在抵抗压力引起的炎症和细胞程序性死亡中的具有关键作用。激活HSF1可以抑制IL-1β介导的炎症，而破坏HSF1则会在应对内毒素压力时增加促炎性TNF-α和IL-6的产生[3]。

也有文献报道显示Notch1与HSF1的启动子结合以调节热休克反应途径[4]。

二．文献脉络

三．正文

1. JAG1介导的髓系Notch1信号减轻IR应激的肝细胞损伤

分别用JAG1（Notch1配体）与PBS处理的髓系特异性Notch1敲除（Notch1M-KO）和Notch1正常的小鼠进行肝脏IR。缺血90分钟，再灌注6小时后，与PBS处理组对比，JAG1处理明显降低了Notch1正常小鼠的血清ALT水平（图1A）。同时，无论是否经过JAG1处理，骨髓Notch1敲除都会增加小鼠的血清ALT水平。这个结果与HE染色的结果一致（图1B）。PBS处理的Notch1正常的小鼠在肝脏IRI后表现出中度至重度水肿、窦道充血和坏死，而JAG1处理的小鼠水肿和窦道充血减少，坏死轻微。然而，Notch1M-KO小鼠即使在同时接受JAG1治疗后，也表现出更严重的组织学损害。经JAG1处理的Notch1正常的小鼠显示MPO水平明显下降，而Notch1M-KO的MPO水平上升（图1C），炎症因子TNF-α、IL-1β、趋化因子CXCL-10、CXCL-2、MCP1和CXCL-1的mRNA表达也上升，表现出相一致的结果（图1D）。

2. JAG1介导的髓系Notch1信号促进HSF1/Snail的激活，并抑制TXNIP/NLRP3的激活,减少巨噬细胞/中性粒细胞肝脏的浸润

接下来，研究人员探究在肝脏IR损伤中，JAG1介导的骨髓Notch1信号传导是否会影响HSF1和Snail的激活.

在Notch1正常的小鼠中，与PBS处理组相比，JAG1处理组增加了NICD、HSF1、Snail和硫氧还蛋白（TRX）1的表达，但减少了硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）、NLRP3、ASC和裂解的caspase-1蛋白的表达（图2A）。（其中NICD是Notch1的胞内结构域；TRX1是硫氧还蛋白，是一种抗氧化剂；TXNIP是硫氧还蛋白互作蛋白：抑制硫氧还蛋白系统，抑制细胞增殖，诱导凋亡；NOD样受体NLRO3,接头蛋白ASC，活化的caspase1组成炎症小体）.然而，在Notch1M-KO的小鼠中，经或不经JAG1处理后，减少了NICD、HSF1、Snail和TRX1的激活，增强了TXNIP、NLRP3、ASC和裂解的caspase-1的激活（图2A），也导致血清IL-1β释放明显增加（图2B）。

与PBS处理的对照组相比，JAG1处理的Notch1正常的小鼠肝脏显示CD11b+巨噬细胞（图2C）和Ly6G+中性粒细胞浸润（图2D）减少，而Notch1M-KO小鼠CD11b+巨噬细胞（图2C）和Ly6G+中性粒细胞浸润增多（图2D），即使在JAG1处理的情况下也是。

3. JAG1介导的髓系Notch1信号可减少IR应激的肝细胞凋亡/坏死

为了明确JAG1介导的骨髓Notch1信号的激活是否可以调节肝脏IR损伤的细胞凋亡，研究人员进行了TUNEL染色来分析凋亡情况

与PBS处理的对照组相比，JAG1处理的Notch1正常小鼠的肝脏显示出凋亡的TUNEL+细胞数量减少（图3A）。然而，即使同时进行JAG1处理，Notch1M-KO小鼠的TUNEL+细胞数量也明显增加（图3A）。ELISA试验显示，JAG1处理明显减少了Notch1正常小鼠血清中TNF-α的产生，而Notch1M-KO小鼠则显示TNF-α产生的增加（图3B）。WB显示，与PBS处理的对照组相比，Notch1正常小鼠的肝脏中的JAG1处理使Bcl-2和Bcl-xL表达上调，而p-ASK1和裂解的caspase-3表达下调（图3C）。相反地，Notch1M-KO小鼠肝脏显示出Bcl-2和Bcl-xL的表达减少，但p-ASK1和裂解的caspase-3的表达增加（图3C）。此外，在Notch1M-KO小鼠中观察到HMGB1的产生增加，但在JAG1处理的Notch1正常小鼠中没有增加（图3D）（PS：HMGB1晚期是促炎作用，当HMGB1与RAGE和TLR结合后，均能活化NF-KB，导致NF-KB核内转移，从而诱导下游多种基因的表达 ）

4. 髓系Notch1信号诱导的HSF1表达激活了Snail并调节了IR应激肝脏中NLRP3介导的免疫反应

接下来，研究人员研究了骨髓Notch1信号诱导的HSF1在肝脏IR中的功能

表达HSF1（Lv-HSF1）与GFP对照（Lv-GFP）的慢病毒转染BMMs（骨髓间充质干细胞），并通过缺血1h前尾静脉注射到Notch1M-KO小鼠体内。与对照组相比，用HSF1转染处理的Notch1M-KO小鼠的肝脏显示了IR诱导的肝细胞损伤的减少，损伤组织学评分（图4A）和sALT水平（图4B）也显示了一致的结果.同时，采用HSF1转染的Notch1M-KO小鼠的肝脏中，显示4-羟基壬醛（4-HNE）的表达减少，这是ROS产生的标志（图4C）

与对照组相比，用HSF1转染组显示Snail和TRX1的表达增加，但TXNIP、NLRP3和ASC的表达减少（图4D），也伴随着IL-1β释放的减少.

5.髓系Notch1信号以Snail依赖的方式抑制IR应激肝脏中的NLRP3的活化

由于骨髓Notch1诱导的HSF1信号促进了Snail在IR受压肝脏中的激活，研究人员接着探究Snail是否调节肝脏IR中NLRP3的活化来发挥效应

在JAG1处理的Notch1正常的小鼠中体内注射Snail siRNA，Snail的沉默明显增加了sALT水平（图5A）和IR诱导的肝脏损伤（图5B）,也增加了CD11b+巨噬细胞（图5C）和中性粒细胞（图5D）的浸润.此外，Snail沉默减少了TRX1的表达，但增强了TXNIP、NLRP3、ASC和裂解caspase-1的表达（图5E），导致IL-1β产生增加（图5F）和炎症因子TNF-α、IL-1β、和趋化因子CXCL-10、CXCL-2和MCP1的表达增加（图5G）

6.Notch1信号诱导的HSF1表达促进了巨噬细胞中Snail的激活并抑制了NLRP3的活化

在证明了JAG1介导的骨髓Notch1信号在体内调控HSF1/Snail进而调控NLRP3功能后，研究者接下来探究了HSF1和Snail之间是否存在串扰，从而影响NLRP3介导的免疫反应。研究人员发现在JAG1处理后，Notch1正常小鼠的NICD,HSF1和Snail蛋白表达增加（图6A）,而在Notch1M-KO小鼠中抑制了HSF1和Snail的表达（图6A）。免疫荧光染色显示，JAG1处理后，Notch1FL/FL中的Snail表达增加，但Notch1M-KO中的Snail表达并没有增加（图6B）.此外，与对照组细胞系相比，HSF1 KO细胞系，Snail表达减少，但NLRP3和ASC表达增加（图6C）。免疫荧光染色数据进一步证实了这一点，显示Snail的表达下降（图6D），这伴随着TNF-α、IL-1β、CXCL-10、CXCL-2和MCP1的mRNA表达增加（图6E）

7.在巨噬细胞中，Snail对Notch1信号介导的NLRP3的调节至关重要

为了研究Snail在Notch1信号介导的免疫调节中调节NLRP3功能的机制，用Snail KO与对照载体转染Notch1正常小鼠的BMMs，然后用JAG1和LPS处理。与对照载体处理相比，Snail KO细胞系，TRX1表达减少，但TXNIP、NLRP3、ASC和c-caspase-1表达明显增加（图7A），同时伴随着ROS产生（图7B）、caspase-1活性（图7C）和IL-1β释放（图7D）增加。相比之下，用Snail转染Notch1M-KO细胞诱导Snail，与对照载体处理的细胞相比，TRX1表达增加，TXNIP、NLRP3、ASC和c-caspase-1表达减少（图7E），ROS产生（图7F），caspase-1活性（图7G）和IL-1β释放（图7H）都是下降的。

8.Snail在Notch1信号介导的免疫调节过程中，对肝细胞凋亡/坏死的调节至关重要

为了探究JAG1介导的Notch1信号参与调控肝脏IR损伤期间肝细胞凋亡/坏死的分子机制，我们使用了BMMs/肝细胞共培养系统（图8A）。来自Notch1正常小鼠的BMMs转染Snail KO和对照载体，然后用JAG1和LPS进行处理，再与补充了H2O2的肝细胞共培养（模拟一个缺氧环境）。结果发现，与对照载体处理组相比，转染了Snail KO的BMMs在共培养上清液中的TNF-α（图8B）和HMGB1（图8C）的释放明显增加。Snail KO-BMMs共培养后，观察到缺氧的肝细胞的LDH释放增加，而与对照组处理的细胞则没有明显变化（图8D）。p-ASK1和c-caspase-3的表达也明显增加（图8E）。此外，免疫荧光染色显示，与对照组相比，与Snail KO-BMMs共培养后，TUNEL+肝细胞数量增加（图F）,即肝细胞的凋亡增加。

四．结论（机制图）

IR损伤激活Notch1信号，并诱导肝脏产生ROS。Notch1与配体JAG1结合后，Notch1被γ-分泌酶裂解，释放出细胞内结构域（NICD），该结构域转入细胞核，与CSL DNA结合蛋白形成复合物，激活HSF1,HSF1又促进Snail的激活，Snail可以抑制ROS的产生并调节硫氧还蛋白，硫氧还蛋白互作蛋白和ASK1，导致ROS诱导的肝细胞凋亡/坏死减少以及NLRP3炎症小体活化减少。

通过确定JGA1介导的髓系Notch/HSF1/Snail信号调节NLRP3介导的先天免疫分子途径，为改善无菌性炎症性肝损伤的治疗提供了理论依据。

五.参考文献

1.Hotz B, Visekruna A, Buhr HJ, Hotz HG. Beyond epithelial to mesenchymal transition: a novel role for the transcription factor Snail in inflammation and wound healing. J. Gastrointest. Surg. 2010;14:388–397. doi: 10.1007/s11605-009-1068-3

2.Kim NH, et al. Snail reprograms glucose metabolism by repressing phosphofructokinase PFKP allowing cancer cell survival under metabolic stress. Nat. Commun. 2017;8:14374. doi: 10.1038/ncomms14374

3.Tanaka K, et al. Genetic evidence for a protective role for heat shock factor 1 and heat shock protein 70 against colitis. J. Biol. Chem. 2007;282:23240–23252. doi: 10.1074/jbc.M704081200

4.Xie Y, Chen C, Stevenson MA, Auron PE, Calderwood SK. Heat shock factor 1 represses transcription of the IL-1beta gene through physical interaction with the nuclear factor of interleukin 6. J. Biol. Chem. 2002;277:11802–11810. doi: 10.1074/jbc.M109296200

原文链接：Yuting J, et al.Jagged1-mediated myeloid Notch1 signaling activates HSF1/Snail and controls NLRP3 inflammasome activation in liver inflammatory injury.Cell Mol Immunol.2020 Dec; 17(12): 1245-1256.doi: 10.1038/s41423-019-0318-x

六．杂志简介

Cellular & Molecular Immunology是国内第一本免疫学英文杂志，是中国免疫学会和中国科学技术大学联合主办的杂志，由Nature Publishing Group出版社发行，于2004年创刊。杂志主编为曹雪涛院士和田志刚院士，杂志的其他编委会成员多为咱国人学者及华人学者。目前，影响因子IF:22.096，JCR分区：免疫学1区；中科院分区：大类医学1区，小类免疫学1区。在161本免疫学SCI期刊中，CMI杂志的SCI影响因子排名6，名列前茅，不输于欧美各大学会官刊。CMI杂志主要接收免疫学相关的基础研究及临床应用类学术论文文章，类型上，以论著和综述文章为主，以及一定比例的社论、读者来信等其他类型文章。

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